體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)儀  技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)儀  技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)

一、 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)儀儀器介紹

體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)儀實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

本試驗(yàn)用于檢測(cè)受試物對(duì)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因突變作用,包括堿基對(duì)突變、移碼突變和缺失等,從而評(píng)價(jià)受試物引起突變的可能性

體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)儀實(shí)驗(yàn)概述：

本試驗(yàn)屬正向突變?cè)囼?yàn),可檢出堿基置換型致突變物和移碼型致突變物。在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下,使細(xì)胞暴露于受試物一定時(shí)間,然后將細(xì)胞傳代培養(yǎng)。胸苷激酶水平正常的細(xì)胞對(duì)三FU胸苷（trifluorothymidine,TFT）等敏感,因而在培養(yǎng)液中不能生長(zhǎng)分裂,突變細(xì)胞則不敏感,在含有三FU胸苷的選擇性培養(yǎng)液中能繼續(xù)分裂并形成集落。相似的,次黃嘌LING鳥(niǎo)嘌LING磷酸核糖基酶(HPRT)正常的細(xì)胞對(duì) 6-硫代鳥(niǎo)嘌LING（6-thioguanine,6-TG）敏感,突變的細(xì)胞則不敏感,在含有 6-硫代鳥(niǎo)嘌LING的選擇性培養(yǎng)液中可生長(zhǎng)形成集落。基于突變集落數(shù),計(jì)算突變頻率以評(píng)價(jià)受試物的致突變性。

體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)儀應(yīng)用范圍

應(yīng)用于科研、農(nóng)業(yè)、衛(wèi)生、教育、霧霾狀態(tài)可吸入顆粒染毒效果研究等各個(gè)領(lǐng)域

體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)儀符合標(biāo)準(zhǔn)：

GB/T 15670.20-2017《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法第20部分:體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)》

二、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)儀試驗(yàn)流程

1）細(xì)胞培養(yǎng):

選擇合適細(xì)胞系（如L5178Y、CHO），常規(guī)傳代培養(yǎng)

2）受試物處理:

暴露于不同濃度受試物（需設(shè)陰性/陽(yáng)性對(duì)照）

3）表達(dá)期:

預(yù)留足夠時(shí)間（通常7-10天）使突變表型顯現(xiàn)。

4）突變體篩選:

TK試驗(yàn):使用三FU胸苷（TFT）篩選TK突變體。

HPRT試驗(yàn):使用6-硫代鳥(niǎo)嘌LING（6-TG）選HPRT突變體。

5）克隆形成分析:

計(jì)數(shù)突變集落，計(jì)算突變頻率（突變集落數(shù)/存活細(xì)胞數(shù)）

6）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):

與對(duì)照組比較，判斷突變率是否顯著增加。

三、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)儀注意事項(xiàng)

1）細(xì)胞活力控制:受試物濃度需保證細(xì)胞存活率（通常>50%）

2）代謝活化系統(tǒng):需加入S9混合物(模擬體內(nèi)代謝，（如Aroclor 1254誘導(dǎo)的大鼠肝S9）。

3）假陽(yáng)性/陰性:避免pH、滲透壓等非特異性因素干擾。

4）合規(guī)性:   遵循國(guó)際指南（如OECD 490、ICH S2R1）。

計(jì)算